巢式PCR检测植物组织痕量内生真菌的方法及其引物
DetectionofTraceEndophyticFungiinPlantTissues
byNestedPCRanditsprimers.
张宇薇2，杨预展2，袁志林1,2,*
1林木遗传育种国家重点实验室，中国林业科学研究院，北京；2中国林业科学研究院亚热带林业研究所，杭州
*通讯作者邮箱：yuanzl
caf.ac.cn摘要：真菌的转录间隔区(InternalTranscribedSpacer,ITS)能有效在种的水平上区分真菌类群，是研究真菌多样性的理想条形码。巢式PCR以两对真菌特异性ITS转录间隔区引物进行两轮巢式PCR扩增，最终高效扩增出植物根系和叶片组织中内生真菌的ITS1和ITS2片段，解决了目前植物内生真菌群落高通量测序建库过程中遇到的非特异性扩增(植物源ITS)这一技术瓶颈。
关键词:PCR，内生真菌，ITS，引物
材料与试剂
1.用于扩增植物组织中内生真菌ITS的引物
引物包括巢式PCR第一轮扩增引物对和巢式PCR第二轮扩增引物对；
巢式PCR第一轮扩增引物对：
①、正向引物NSA3:5′-AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA-3′,
反向引物NLC2:5′-GAGCTGCATTCCCAAACAACTC-3′;
②、正向引物NSI1:5′-GATTGAATGGCTTAGTGAGG-3′,
反向引物NLB4:5′-GGATTCTCACCCTCTATGAC-3′;
巢式PCR第二轮扩增引物对为以下任一引物对：
①、正向引物ITS1-F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′,
反向引物ITS2:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′;
②、正向引物ITS1-F_KYO2:5′-TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAA-3′,
反向引物ITS2_KYO2:5′-TTYRCTRCGTTCTTCATC-3′;
③、正向引物fITS7:5′-GTGARTCATCGAATCTTTG-3′,
反向引物ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′;
④、正向引物ITS3_KYO2:5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′,
反向引物ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
2.PCR反应液(见溶液配方)
3.DNeasyPlantMiniKit试剂盒(QIAGEN公司,catalognumber:)
4.AxyPrepDNAGelExtractionKit试剂盒(康宁生命科学有限公司,AxyPrep,catalognumber:AP-GX-50)
5.碎冰
6.各种型号枪头
7.离心管(2ml、1.5ml)
8.异丙醇(国药集团化学试剂有限公司,沪试,catalognumber:)
9.无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司,沪试,catalognumber:)
10.胰蛋白胨(杭州微生物试剂有限公司,HANWEI,catalognumber:Y)
11.NaCl(国药集团化学试剂有限公司,沪试,catalognumber:)
12.酵母提取物(yeastextract)(Oxoid公司,Oxoid,catalognumber:LP)
13.琼脂(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司,DINGGOU,catalognumber:DH-1.1)
14.氨苄青霉素(Ampicillin)(生工生物工程(上海)有限公司,Amresco,catalognumber:)
15.3%X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)(北京索莱宝科技有限公司,Solarbio,catalognumber:X-25)
16.20%IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)(北京百奥莱博科技有限公司,百奥莱博,catalognumber:GL-PYO)
17.含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板(预先滴加40μ13%X-gal和7μ%IPTG)(见溶液配方)
18.超纯水
19.pGEM-TEasy载体(Promega公司,Promega,catalognumber:A)
20.感受态细胞EscherichiacoliJM(Promega公司,Promega,catalognumber:L)
21.DNAMarker(康为世纪公司,cwbio,catalognumber:CW)
22.制冰机(上海易汇生物科技有限公司,易汇,catalognumber:IMS-20)
仪器设备
1.超净工作台
2.研钵
3.移液枪(2.5μl、10μl、20μl、μl、μl、0μl)
4.离心机(杭州卡培恩生物技术公司,SIGMA,catalognumber:3K1S)
5.超微量核酸蛋白测定仪(Quawell公司,Quawell,catalognumber:Q)
6.-20℃冰箱
7.MyCyclerPCR扩增仪(Bio-Rad公司,Bio-Rad,catalognumber:MyCycler)
8.手术刀
9.电子精密天平(上海民桥精密科学仪器有限公司,MINQIAO,catalognumber:JAFA/JA系列)
软件和数据库
1.VecScreen(